荧光素酶报告基因检测的操作步骤

    荧光素酶检测系统，可用裂解液来温和而快速地提取真核细胞中的荧光素酶，用其底物来检测荧光素酶活性。检测步骤如下：

1）加裂解缓冲液裂解转染的细胞。

2）将上述裂解物转移入微孔板或者试管中（根据检测的需要选择所用器材类型）。

3）加入含有所有酶反应成分（必须包括底物荧光素），使化学发光反应开始。

4）使用荧光仪或者液闪计数仪检测所发射的荧光。

实验步骤：

注：该操作流程通常用来检测转染了萤火虫荧光素酶基因的真核细胞中荧光素酶表达的活性，不适用于对细菌荧光素酶进行检测。

1．实验第一天，消化并接种细胞（根据具体实验选择合适的细胞）于35mm细胞培养皿，置于5％CO2、饱和湿度的37℃培养箱内培养过夜。

2．等细胞密度达到70％时用Luciferase报告基因质粒、LacZ的表达质粒及其它质粒（根据具体实验确定）共转染细胞（根据具体实验选择转染方法，如磷酸钙沉淀法、PEI、lipofectamine2000等均可）。

3．转染24－36h后，吸去培养液，用预冷的PBS（无钙和镁离子）洗涤细胞。

注：荧光酶的酶促反应会被痕量的钙所抑制，故用磷酸钙转染的细胞在收集细胞前应充分洗涤除去含钙介质。

4．在每个培养皿中加入350μl预冷的harvest buffer,于4 ℃或冰上放置10min裂解细胞。

5．在细胞裂解期间，准备足量的1.5 ml微量离心管，将ATP buffer 与luciferin buffer 以1：3.6比例混合成反应液后分装，每管100μl。

6．依次取等体积的细胞裂解液（100μl）至步骤5中的离心管中，迅速混匀，在发光仪（Luminometer）上读取吸光值。

注：发光反应会迅速衰减，将细胞裂解液加入反应液后5s内必须读取吸光值。

7．确保以相同操作手法读取全部样品吸光值后。

8．取剩余裂解液测定LacZ的活性，其读数作为内标用以矫正荧光素酶的读数。

9. 用矫正后的读数作图，分析数据。

注：荧光素见光易氧化，已稀释未用的荧光素应丢弃。

注意事项：

1.荧光素酶检测试剂需在15-25℃条件下预平衡后再进行反应，而后依据具体条件进行自动或手动检测。当用液闪计数仪时，加入荧光素酶检测试剂后立即轻轻混匀。

2.如果细胞裂解后不能立即对提取物进行检测，样品可以在冰上保存大约5h，在-70℃可保存数月。不要反复冻融以避免酶活性的降低。

3.利用上述方法检测冷的样品时，其信号强度将下降5-15%。

4.在荧光素酶活性较高的情况下，导致信号超出线性范围（信号溢出）可用裂解液将样品进行稀释。

5.不要储存稀释过的样品。如果必须保存，要在稀释的样品中加入BSA至终浓度为2.5mg/ml，这样可以保持样品的稳定性。

6.一些荧光仪在进行检测前需要1-2s的稳定，因此建议在开机后过一段时间再进行检测操作。