GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF 谷胱甘肽高速纯化树脂（用于GST标签蛋白纯化）
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 储存 | 价格（元） |
GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF 谷胱甘肽高速纯化树脂（用于GST标签蛋白纯化） | 20508ES10 | 10ml | 4℃ | 1238.00 |
20508ES50 | 50ml | 4℃ | 4568.00 |
20508ES60 | 100ml | 4℃ | 7928.00 |
产品描述
GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF是一种GST标签蛋白纯化树脂，结构上是以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质，通过12个原子的间隔臂，用化学方法共价结合还原型谷胱甘肽制作而成，具有更高的物理化学特性，可以耐受更高的压力，在相对较高的流速下，实现对目的蛋白的纯化，更适于工业大规模蛋白的纯化。
此外，本品特异性好，性价比高，可以一步纯化各种表达系统中谷胱甘肽-S-转移酶、谷胱甘肽依赖性蛋白和谷胱甘肽重组衍生物。
产品性质
基质（Matrix） | 高度交联的4%琼脂糖微球 |
配体（Ligand） | 通过12原子间隔臂偶联的谷胱甘肽 |
孔径（Bead size） | 45-165μm |
载量（Capacity） | ＞10mg GST protein/ml 基质（40kDa） |
最大压力（PressureMax） | 0.3 MPa, 3bar |
pH稳定范围（pH range） | 3-12 |
储存缓冲液（Buffer） | 20%乙醇 |
运输和保存方法
冰袋运输。4℃保存，有效期2年。
需准备试剂
所用水和Buffer在使用前最好用0.22μm或0.45μm滤膜过滤除菌。
结合/洗杂缓冲液：PBS，pH7.4(140mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, pH7.4)
洗脱缓冲液：50mM Tris-HCl, 10mM 还原型谷胱甘肽，pH 8.0
【注】：结合/洗杂缓冲液或者洗脱缓冲液中可加入1-10mM DTT。
使用方法
【注】样品在上样前最好用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，减少杂质以防阻塞柱子。
1 GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF的装填（适用于各种中压色谱层析柱的填装）
1）用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2cm的去离子水。
2）将树脂悬浮起来，小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。
3）如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。
4）打开层析柱底部出口，开起泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速， 这样可避免液压对所形成柱床的冲击，避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速，可以用所使用泵的最大流速，这样也可以得到一个很好的装填效果。
【注】：在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%，当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。
5）关闭泵，关闭层析柱出口。
6）如果使用储液器，去除储液器，将分配器至于层析柱中。
7）将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。
8）将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。
2 样品纯化
1）平衡：用5倍柱体积的结合Buffer平衡柱子，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。
2）上样：Resin平衡后，加入蛋白样品，使其与Resin充分接触，提高目的蛋白回收率，收集流出液。
3）洗杂：用10-15倍柱体积的洗杂缓冲液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
4）洗脱：使用5-10倍柱体积的洗脱缓冲液，收集洗脱液，即目的蛋白溶液。
5）清洗与保存：依次使用3倍柱体积的结合Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%乙醇中，置于4℃保存，防止填料被细菌污染。
3 SDS-PAGE检测
将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。
4 填料清洗
GST标签蛋白纯化产品可以重复使用而无需再生，但随着非特异结合蛋白的增多和蛋白的聚集，会造成流速和结合载量性能下降，此时需对填料进行清洗。
1）去除一些沉淀或变形物质
用2倍柱体积的6M 盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS，pH7.4清洗。
2）去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质
用3-4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积1% Triton X-100清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS，pH7.4清洗。
注意事项
1）请勿冷冻保存本产品。
2）GSTSep Glutathione Agarose Resin使用前一定要充分颠倒若干次，使琼脂糖珠混合均匀。
3）所有操作过程中，样本需要在4℃或冰上操作。
4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
附表 问题及解决方案
问题 | 可能原因 | 推荐解决方案 |
柱子反压过高 | 填料被堵塞 | 清洗树脂。 |
裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上样前最好用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，或离心去除。 |
样品太黏稠 | 样品中含高浓度的核酸，延长破碎时间直至粘度降低，或添加DNaseI （终浓度为5μg/ml），Mg2+(终浓度1mM)，冰上孵育10-15min |
缓冲液太黏稠 | 有机试剂或蛋白稳定试剂（如甘油等）可能会引起反压增高，降低操作流速。 |
洗脱组分中无目的蛋白 | GST标签蛋白变性了 | 使用温和的裂解条件，实验条件以经验为准。 |
过度的裂解使目的蛋白变性 |
目的蛋白聚集产生沉淀 | 在细胞裂解前溶液中加入DTT，终浓度为1-10mM |
融合蛋白改变了GST的构象，影响了目的蛋白的结合力 | 测定pGEX中GST的结合力，对载体进行超声处理，检测其结合力。如果载体中GST有很高的亲和力，有可能是改变融合蛋白的构象从而降低了GST标签蛋白的亲和力。 |
降低结合温度至4℃，充分清洗。 |
柱子平衡时间太短，目的蛋白不是在pH6.5-pH8.0范围内结合 | 用pH6.5-pH8.0的buffer进行充分的平衡，如PBS. |
目的蛋白没有完全洗脱下来 | 洗脱体积太少 | 增加洗脱液体积，减小洗脱流速。 |
洗脱液中谷胱甘肽浓度太低 | 增加洗脱液中谷胱甘肽浓度，可尝试用50mM Tris-HCl, 20-40mM还原型谷胱甘肽pH8.0洗脱 |
低pH影响洗脱 | 在不增加洗脱液中谷胱甘肽量时，提高洗脱液中pH至pH8-9会有改善 |
增加洗脱液中离子强度，如0.1-0.2M NaCl |
洗脱液中谷胱甘肽被氧化 | 使用新鲜配制的洗脱液 |
加入DTT |
非特异性疏水作用影响目的蛋白的溶解和洗脱 | 洗脱液中加入非离子型洗涤剂，如0.1%的Triton X-100或者2%正辛基-β-D-吡喃葡糖苷Tween-20 |
电泳或western blot检测中发现多条带 | Mr 70000蛋白与目的蛋白一起纯化下来 | Mr 70000蛋白可能是大肠杆菌基因DnaK的产物，可以在目的蛋白中加入50mM Tris-HCl, 2mM ATP, 10mM MgSO4, pH 7.4在37℃加热10min去除。 |
可通过ATP-琼脂糖胶或离子交换来去除目的蛋白溶液中的dnaK蛋白 |
GST融合蛋白已经发生降解 | 在裂解液中加入蛋白酶抑制剂，如加入1 mM PMSF |
可能是蛋白酶对目的蛋白部分降解造成的，可使用蛋白酶缺陷型宿主菌（如lon-或ompT） |
细胞破碎过度 | 减少细胞破碎时间，超声前加入溶菌酶（菌液体积的0.1倍10mg/ml溶菌酶，25mM Tris-HCl，pH8.0），避免发泡导致蛋白酶变性，过度超声破碎增加宿主内源蛋白与GST融合目的蛋白的共纯化。 |
共价共纯化 | 包括促进蛋白正确折叠的分子伴侣的共纯化，如：DnaK(Mr～70000), DnaJ(Mr～37000), GrpE(Mr ～40000), GroEL(Mr～57000), GroES(Mr～10000) |
抗体与E. coli的各种蛋 白反应 | 抗体吸附E. coli蛋白：GST-抗体；超声处理去除GST抗体，可以用Western Blot检测 |
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